實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。PCR實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中常見用的實(shí)驗(yàn)之一，在基因擴(kuò)增、核酸檢測(cè)、基因檢測(cè)等方面廣泛應(yīng)用。PCR實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備:
在開始PCR實(shí)驗(yàn)之前，必須準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設(shè)計(jì)或用軟件設(shè)計(jì)），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡拿?span style="font-size: 14px; box-sizing: border-box;">)
2、引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設(shè)計(jì)對(duì) PCR 擴(kuò)增的成功至關(guān)重要。當(dāng)您開始設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個(gè)原則：
①引物的長(zhǎng)度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對(duì)于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長(zhǎng)的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設(shè)計(jì)，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。
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